(1)放射性核素与非放射性标记探针双标记原位杂交
非放射性标记原位杂交技术的兴起和发展为双标记原位杂交提供了有效的技术途径。在将放射性核素和非放射性物质标记的两种探针组合在一起的双标记原位杂交技术中，常用的放射性核素标记为35S，常用的非放射性标记为生物素和地高辛。这种双原位杂交技术可分为一步法和两步法。在一步法中，用两种探针的混合物一次性完成原位杂交反应。当显示杂交信号时，首先将碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与杂交体上的生物素结合，并使用硝基四氢呋喃。 NBT 和 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐 (BCIP) 用作底物。将碱性磷酸酶展示在杂交体上（或使用ABC法将生物素展示在杂交体上）或用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合，并使用NBT和BCIP展示碱性磷酸酶，样本在进行放射自显影处理以揭示另一种目标核酸之前会被脱水和干燥。一步法的优点是杂交反应一步完成，操作过程短，同一细胞内的两个信号易于区分；缺点是放射自显影的阳性信号明显小于单一标记，并且碱性磷酸酶或ABC产物的阳性反应可能会导致核心乳胶的化学显影。在两步法中，两次杂交反应使用不同的探针。通常，首先使用35S标记的探针进行原位杂交。在通过放射自显影显示第一个杂交体后，使用生物素或地高辛标记的探针。将探针进行第二次原位杂交，按照生物素-亲和素-碱性磷酸酶法(或ABC法)或地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶法展示第二次杂交体。 。两步法的杂交信号在显微镜下清晰可见。使用放射性核素标记探针进行首次原位杂交的整个操作流程，包括放射自显影和固定过程，不会改变mRNA的结构，也不会影响杂交过程中靶核酸与探针的配对。第二次杂交反应。的可访问性。两步法整个操作流程比一步法长，但没有一步法中放射性标记信号丢失的缺点，也没有碱性磷酸酶可能存在的缺点（或 ABC）可能导致乳胶化学反应的阳性反应产物。
(2)非放射性标记探针双标原位杂交
如果不同的核酸探针标记不同的标记，只要不影响彼此的杂交反应，检测系统互不干扰，杂交信号易于区分，原则上都可以用于双或多标记原位杂交。使用非放射性标记探针进行双标记原位杂交。它可以克服放射性核素标记探针分辨率低、时间长、放射性污染等缺点。
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